|
|
Structural characterization of influenza A polymerase PA subunit domains in complex with novel inhibitors
Radilová, Kateřina ; Kožíšek, Milan (vedoucí práce) ; Rumlová, Michaela (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je heterotrimerický komplex, který má zásadní roli v životním cyklu viru. Je zodpovědná za virovou replikaci a transkripci. Jedna z jejích podjednotek, PA podjednotka, interaguje s PB1 podjednotkou prostřednictvím důležité protein-proteinové interakce na své C-koncové doméně. Tato interakce, která je zprostředkovaná 310 helixem, je nutná k utvoření celého heterotrimerického komplexu. N-koncová doména navíc obsahuje místo s endonukleasovou aktivitou se dvěma manganatými ionty. Obě tyto domény jsou považovány za slibné terapeutické cíle. V současnosti jsou přístupy v léčbě a prevenci chřipkového onemocnění limitované na sezónní očkování a existuje pouze několik léků, které ve velké většině cílí na jiné proteiny viru chřipky. U řady z nich však dochází k rychlému vývoji rezistentních mutací, nebo mají závažné vedlejší účinky. Tato práce nabízí strukturní náhledy na dvě domény PA podjednotky. První část se věnuje charakterizaci a optimalizaci minimálního peptidu odvozeného z PB1 podjednotky, který interaguje s C-koncovou doménou PA podjednotky a brání jejich dimerisaci. Výsledky z této části mohou být považovány za počáteční bod pro racionální vývoj prvních inhibitorů PA-PB1 protein-proteinové interakce proti viru chřipky. V druhé polovině jsme zkoumali...
|
|
|
Development of high-throughput screening assay for the identification of inhibitors targeting influenza A polymerase
Karlukova, Elena ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky způsobuje infekční oněmocnění, postihující 3 až 5 milionů jedinců ročně. V současné době se k lečbě chřipkových infekcí používají dva druhy léčiv: inhibitory neuraminidasy a inhibitory iontového kanálu M2. Vzrůstající počet kmenů resistentních vůči těmto inhibitorům a riziko vzniku nových pandemických kmenů však vytvářejí dosud neuspokojenou potřebu nového typu inhibitorů. RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je novým cílem pro vývoj inhibitorů směrovaných proti viru chřipky. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout vysokokapacitní testovací metody pro nalezení potenciálních inhibitorů dvou aktivit chřipkové polymerázy - vazby 7-methylguanosinové čepičky hostitelských RNA a jejich enodukleasové štěpění. Pro doménu vázající 7-methylguanosinovou čepičku bylo testování založeno na metodě DIANA (DNA-linked Inhibitor ANtibody Assay), která byla nedávno vyvinuta v laboratoři školitele; testování inhibitorů endonukleasové domény pak bylo založeno na technologii AlphaScreen. Pro potřeby vývoje velkokapacitních testovacích metod byla připravena rekombinantní doména vázající 7-methylguanosinovou čepičku z podjednotky PB2 a N-koncová doména PA podjednotky chřipkové polymerasy, nesoucí endonukleasovou aktivitu. Oba rekombinantní proteiny byly exprimovány s příslušnými afinitními značkami a...
|
|
|
Interdoménové a intradoménové interakce u motorové podjednotky EcoR124I: Výpočetní studie
SINHA, Dhiraj
EcoR124I is a Type I restrictionmodification (RM) enzyme and as such forms multifunctional pentameric complexes with DNA cleavage and ATP-dependent DNA translocation activities located on the motor subunit HsdR. When non-methylated invading DNA is recognized by the complex, two HsdR endonuclease/motor subunits start to translocate dsDNA without strand separation activity up to thousands base pairs towards the stationary enzyme while consuming ~1 molecule of ATP per base pair advanced. Whenever translocation is stalled the HsdR subunits cleave the dsDNA nonspecifically far from recognition site. The X-ray crystal structure of HsdR of EcoR124I bound to ATP gave a first insight of structural/functional correlation in the HsdR subunit. The four domains within the subunit were found to be in a square planer arrangement. Computational modeling including molecular dynamics in combination with crystallography, point mutations, in vivo and in vitro assays reveals how interactions between these four domains contribute to ATP-dependent DNA translocation, DNA cleavage or inter-domain communication between the translocase and endonuclease activities.
|
host ::
RSS.